风湿热(rheumatic fever，RF)是A组乙型链球菌(GAS)感染咽喉部后引起的一种自身免疫性疾病。脂磷壁酸(1ipoteichoic acid，LlIA)足GAS的主要抗原之一.TA是GAS侵犯人咽喉部时与人的上皮细胞结合的起粘附作用的附因子lA抗体可阻断GAS对上皮细胞的粘附，M蛋白抗体及I抗体是重要的调理素。有实验表明风湿性心脏病病人比正常人更易检测到高滴度的A抗体。高滴度的抗体更常见于活动期风湿性心脏炎的病人。LTA在RF的发病过程巾起何作用是值得探讨的问题。本文就(-AS脂磷壁酸提取及其在RF发病中的意义作了些初步探讨，现报告如下。

　　1材料和方法

　　1主要试剂

　　二乙基氨基纤维素(DEAE—Scphacel)(美国sma公司);曲通114(Trit。n x一114)(美国sigm司);硝酸纤维膜(美国Millpore公司);小牛血清白蛋白(BsA)：山羊抗人辣根过氧化物酶(tRF，)1gG(slgma公司);底物[二氨基联苯胺过氧化氢(DAB H10)(武汉博十得公司)。1.2脂磷壁酸的提取1.2.1准备细菌：实验时将保留的GAs菌株进行解冻与复苏，n平皿上进行纯培养数次后，用接种环挑取单个溶血环较大的菌落移入肉汤培养基中进行数次增菌培养;用生理盐水洗涤细菌3次。湿菌置7超低温冰箱中保存备用。1.2 2用Tx一114提取湿细菌1 g混悬于预冷的10 ml x一114溶液中，磁力搅拌器低速搅拌，4℃过夜。4℃5 000 r/mln离心30 min去除细胞碎片，收集上层提取物。提取物50℃水30 mln，25℃5 000 r/min离心30 ，使提取物分成两层，轻轻收集上层水相，即为lH的粗提物1 2 3使用阴离子交换树脂T)EAE—sephaccl层析纯化LIIA：准备直径2 cm长2cm的DEAE sephacel层析柱。用0.1 nl，pH 4.7醋酸铵缓冲液预平衡。加入5倍体积pH 4.7醋酸铵缓冲至细菌Tx 114提取物中，稀释后缓慢过柱。进而用同一缓冲液洗脱Tx一114，用紫外分光光度计监测洗脱液在波长275 nm的吸光度(A275)，直到洗脱液A。低于0.001。继以l n1()1，pH 4.7醋酸铵缓冲洗脱结合于柱上的LTA。测定洗脱液的无机磷浓度，以监测、A洗脱峰。收集含磷的洗出液，即为L1'A提取赦。1.2.4 LTA提取液化学成分分析：采用磷蓝比色法测定提取液中磷的含量;甘油三酯酶法测定甘油含量;用超敏感总蛋白定量方，测定提取液中蛋白质含量;紫外分光光度计测A提取物在240～320 mn波艮范围内的A值，检测其纯度1.3 LTA抗原性的测试使用斑点酶联免疫吸附检测(ELIsA)法，步骤参阅文献，简述如下：将A包被在硝酸上一硝酸纤维膜小条置于BsA溶液中一过夜一加入适当稀释后的活动性风湿性心瓣膜炎病人血清一孵育一洗涤一加入适当稀释的山羊抗人HRP—IgG一孵育一洗涤+加入底物溶液一避光反应10 m·n。呈黄色斑点者为阳性反应，提示所提取的LTA有抗

　　1.4 A组乙型链球菌脂磷壁酸瓣膜抗原附试验1.4 1 人心瓣膜抗原的提取：留取慢性风湿性心脏病病人心瓣膜置换术时切除的心瓣膜，剪碎，加入适量O叭m。l/L，pH 7.4的PBs;上述瓣膜碎片加至匀浆器中，制成心瓣膜匀浆;8 000 rtn低温离心20 min，取上清;普通滤纸过滤，收集滤液，滤液即为人心瓣膜抗原提取液。.4.2人心瓣膜抗原测定：用斑点EUSA法测定人心瓣膜提取液的抗原性。除包被抗原为人心瓣膜抗原外，余步骤基本同l 3。结果判定：如黄色斑点则为阳性反应，提示人心瓣膜抗原具有抗原性;不色斑点则为阴性反应，提小人心瓣膜抗原可能不具有抗原性。1.4.3 A组乙型链球茼脂磷壁酸与人心瓣膜抗原吸附试验：IJA抗体阳性血清分两管，一管按一定比例加入人心瓣膜抗原提取液(实验管)，另一管以相同比例加入PI(0.叭n1。l/L，pH 7 2)进行对照(对照管)。两管用PBs(0叭mol/IJ，pH 7.2)进行适当稀释后，放至37℃恒温水浴箱中孵育1 h，再放置40℃冰箱中过夜(24 h)。次日4 000 r/mln离心30 min，留取上清液。上清液即为吸附抗体以后的标本。按前述斑点EIIsA法检测上述吸附抗体后的标本，观察其LI'A抗体是否存在滴度的下降或变为阴性。1.4.4比较10例风湿性心脏病患者的心瓣膜病理活检结果和血清llA.IgG抗体的滴度水平：10例风湿性心脏病患者心瓣膜置换术前取血测定血清LTA—Ig(j抗体。术时切左心耳部心肌和患瓣作病理活检，切片HE染色，普通光镜检查。

　　2结 果

　　2.1 阴离子交换层析对(jAs脂磷壁提取物的纯化：图1为x—114的洗脱曲线，可见0.1mrnol，pH 4.7醋酸铵缓冲液可以将Tx一114先从柱上洗脱下来。图2为I。TA洗脱曲线，可见LTA洗脱峰呈单峰。2.2甘油三酯酶法测定提取液甘油浓度：结果示甘油浓度为0.02 mrn。l/IJ。提取物用紫外分光光度计在240～320 nn·波长范围内进行波长扫描，显示LTA提取液在波长.280 nm附近无残留蛋白质吸收峰，在波长260 nn附近无残留核酸吸收峰。再用超敏感总蛋白定最力法，测定提取液中蛋白质含量，结果示提取物中总蛋白质含量为0 18 mg/lJ，可见纯化后的l。TA提取物纯度较高。用30例风湿性心瓣膜炎病人血清以斑点EusA法测定ITA的抗原性。结果有20例呈现阳性反应，提示所提取的LTA有抗原性。部分风湿性心瓣膜炎病人血清中存在LrA抗体。 2.3 LTA与人心瓣膜抗原吸附试验：包被在硝酸纤维膜}的人心瓣膜抗原分别与3份LTA抗体阳性血清反应，均出现黄色斑点，证实了所提取的人心瓣膜抗原具有抗原性。上述LTA抗体阳性札清加人人心瓣膜抗原提取液，实验管见有少量沉淀出现，而对照管未见有沉淀出现。斑点ELIsA法检测吸附抗体后的标本，结果显示吸附抗体后的实验管标本LTA抗体变为阴性，而对照管LTA抗体仍为阳性。2.4风湿性心脏病患者的心瓣膜病理活检和血清L‘rA—IgG抗体滴度水平比较：血清LTA IgG抗阳性4例(滴度为1=50，正常值为<1：50)，阴性6血清LrAIgG抗体阳性的4例患者中有3例病理切片发现心瓣膜或心肌间质有灶性炎症细胞浸润;血清IJA—IgG抗体阴性的6例病人均未见灶性炎症细胞浸润(Fjher精确概率=0.033)。上述病人均未发现有典型阿少夫小体。

　　3讨 论

　　A组乙型链球菌是公认的风湿热的致病因子。LrA是GAS的主要抗原之一，是带负电荷的与膜相关的多聚体。1976年Beachey等证实L1_A是(AS是侵犯人咽喉部时与人的上皮细胞结合的起粘附作用的粘附因子。有研究认为：GAS的u_A抗体可阻断GAs对上皮细胞的粘附，M蛋白抗体及LrA抗体是重要的调理素，可使动物免于死于GAS的致死性感染。另有实验表明风湿性心脏病病人比正常人更易检测到高滴度的LTA抗体_5，与风湿性关节炎、链球菌感染后反应性关节炎、静止期风湿性心脏病病人相比，高滴度的A抗体更常见于活动期风湿性心脏炎的病人因此Ll_A在风湿热的发病过程中起何作用是值得探讨的问题。要回答此问题，获取较纯的I。TA是关键一一步。本文在国内首先报道应用Tx进行A组乙球菌LTA的提取，结果显示LTA的Tx一114提取阴离子交换树脂DEAE—Sephacel层析洗脱下来洗脱峰呈单峰。收集含磷的洗脱液作为纯化后A提取液。纯化后的IA提取液用紫外分光光度计进行波长扫描，证实无蛋白质及核酸吸收峰，提示不含残留蛋白质及核酸污染。因多糖为不含磷物质，故未对其进行进一步分。再用高灵敏分析方法检测样品的蛋白含量，显示样品所含蛋白质浓度极低(0.18几)，残留微量蛋白质不影响本实验的结果因此，可认为本研究所提取的LTA是较纯的。

　　本文免疫吸附试验所用心瓣膜来自风湿性心脏病患者作瓣膜置换术时切下的患瓣。将所提取的心瓣膜抗原溶液加入LTA IgG抗体阳性的血清中吸附，吸附抗体后的血清LTA IgG抗体转为阴性，而用PBs对照的血清标本LTAIgG抗体仍呈阳性。从而初步证明r A组乙型链球菌L1'A与人心瓣膜存在交叉抗原性。提示在风湿热发病中血清LTA抗体可能为一利咱身抗体，参与了急性风湿热，尤其是风湿性心脏炎的发病过程。有研究已经冠示A组溶A能自主粘附于某些哺乳动物细胞，激活人外周血单核细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和剌激T淋巴细胞有丝分裂，诱导肿瘤坏死因子(TNF)的产生。文献[13]报道I。TA的制剂用于肿瘤的治疗。所以，如果IJ^参与急性风湿热，尤其是风湿性心脏炎的发病过程，则其起作用的机制nJ能是通过细胞免疫和体液免疫两条途径起作用。在带有风湿热易感基因的宿主体内血清LTA抗体可能与其他自身抗体，如链球菌壁多糖抗体起I办同作用，从而使机体对A组性链球菌产生过强的免疫反应。而对于正常人，感染A抗体与M蛋白抗体起调理素的作用，从而抵抗GAS的感染。以上假设有待进一步的实验加以证实。

　　本实验对10例风湿性心脏病作瓣膜置换术的病例进行病理切片和血清uA抗体滴度的对比研究。术前按J。nes标准，木能判断存在有风湿活动。心瓣膜病理切片均未发现有典型的风湿小结，故病理上未达到诊断风湿活动的标准。但血清ITA—抗体测定发现抗体阳性的4例患者巾有3例病理切片发现心瓣膜或心肌间质有较高程度的灶性炎症胞浸润;而血清LTA IgG抗体阴性的6例病人均未发现灶性炎症细胞浸润。结合作者原有的研究结果风湿性心脏炎组LTA IgG抗体滴度水平高于静止期风湿性心脏病组)，故此不排除前述灶性炎症细胞浸润改变为风湿括动的早期病理变化，或是不典型风湿活动的病理改变的可能性。换言之，LTA抗体的存在，可能在一定程度反映了自身免疫的存在.

——转自中华风湿病学杂志

作者：黄建林