目的探讨八肽胆囊收缩素(ccK一8)对肿瘤坏死因子(1、NF)。诱导的大鼠滑膜细胞增生的影响及其可能的分子机制。方法 通过噻唑蓝(Mlrr)比色法检测不同浓度的c(诱导的大鼠滑膜细胞株RSG364细胞、Ⅱ型胶原性关节炎(cIA)大鼠滑膜细胞增生的作用：用酶联善疫吸附(EusA)法测定CCK一8 X~TNF-a作用下RSC-364细胞对白细胞介素(IL)6分泌的仔在的情况。度的CCK 8对RSG364细胞和CIA大啤膜细胞的增生有显著的抑制作用，而1。rml/L浓度的CCK一8对RSC-364细胞IL-6的产则呈刺激作用，CCK的受体拮抗剂丙谷胺可拮抗CCK一8对IL6产量的促{井作用.结论rrK R;在的情况下可抑制大鼠滑膜细胞株RSG364细胞和cIA大鼠滑膜细胞的增生，这种抑制作能是通过促进IL6的产生实现的。提示CCK一8可能具有潜在的调控类风湿关节炎发病i磊晶。

　　【关键词】关节炎，类风湿;

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthntis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，以持续性滑膜炎症、滑膜细胞增生、进行性骨与软骨破坏为病理特征。RA~NPvN，但多数研究认为，免疫平衡失调，尤其是促炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子。白细的过度产生，在RA的发病过程中可能具有重要作用‘近年来的研究表明，除上述因素外，纤维母细胞样滑膜细胞(fibroblsynoviocytes，FLs)可分泌大量的促炎性细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶，导致关节内炎性细胞的聚集、滑膜细胞的增生和向周围组织的侵蚀及基质的破坏和降解，在RA的发病、慢性炎症的维持和骨与软骨的破坏方面具有重要作用。因此，调控FLS的增生和活化，在控制RA的发生和发展中具有重要义。八肽胆囊收缩素(cholecystokinin octapeptide，CCK一8)属于肽类激素，具有明显的抗炎作用。但它对于滑膜细胞的增生和活化是否具有调控作用尚未见报道。本文以大鼠纤维母细胞样滑膜细胞株RSC-364、11型胶原性关节炎(type一2 collagenduced anhritis，C1A)大鼠滑膜细胞为对象，Rg.TCCK一8对其增生的影响，初步探讨了这种影响的可能机制及其用于RA治疗的可能性。

　　1材料和方法

　　1.1主要试剂：硫酸化八肽胆囊收缩素(sCCK 8)、CCK受体拮抗剂丙谷胺(proglumide)、噻唑(MTT)、重组小鼠TNF-a、Ⅱ型胶原(type一2 colla—gen，C1I)、1I型胶原酶(type-2 collagenase)均为。a公司产品，大鼠II。一6酶联免疫吸附(ELISA)法检测试剂盒为Diaclone公司产品，Dulbecco Modi—fied Eagk Medium培养基(DMEM)为Gibico公司出品，胎牛血清购自于北京元亨圣马生物技术研究所.卡介苗(BCG)购于北京生物制品研究所，其余试剂均为国产分析纯。1.2 CIA大鼠类风湿关节炎模型的建立：参照TYentham等的方法进行，选用体重100～150的健康SD大鼠，尾根部皮内注射与福氏完全佐剂等量混合的c11 200 fll/只(含c0.5 mg，BCG4g)，接种后10 d左右动物开始发病，接种后20～30 d动物发病高峰时取滑膜组织进行细胞培养。1.3细胞培养：大鼠滑膜细胞培养参照王斌等。的方法稍加改进进行：无菌操作取大鼠膝关节滑膜组织，剪成1 m1113大小后加入4ml 0.4mg/ml的Ⅱ型胶原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培养基)，于37℃、5%c02条件下孵育3 h，离心贴壁的细胞，将细胞团以0.25%的胰酶消化5 min后，离心、弃上清，将细胞重悬于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 ttg/rot链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%co条件下培养，取3—5代胞用于实验。大鼠纤维母细胞样滑膜细胞传代细胞株RSC一364为北京30I医院骨病研究所黄靖香主任惠赠，所用培养基为含10%胎牛血清、100 U/mI青霉素、100g/m[链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%coe条件下培养，0.25%胰酶消化传代。1.4细胞增生实验：取处于对数生长期的滑膜细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化后，反复吹吸使成单细胞悬液，凋整细胞浓度1×10。eeils/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔200 pl，接种细胞量为2.0×10。37℃5%C02培养箱内培养3 h后，加入不同浓度的CCK一8(10 mo/t。)或丙谷胺CCK一8(10 tool/L)，培养1 h后，加入TNF培养72 h(RSC一364细胞)或120 h(CIA大鼠滑膜细胞)后，加入MTT(5 mg/m1)20。继续培养4 h后，弃去上清液，加入二甲砜(150/L)室温振荡10 min后，于492 nnl波长测定A值，以实验组A值/对照组A值×100%计算细胞增生百分率。

　　1.5 IL一6水平测定：RSC-364细胞(5 5×105ceUs/m1)接种于24孔细胞培养板，每孔1 m1，37℃5%COe培养箱内培养3 h后，加入CCK一8或丙谷胺(2g/L)+CCK 8(10。tool/L)进行预孵育，l h后加入TNF—af10 ng/L)继续培养24 h后，收集上清，ELISA法测定IL-6含量，测定方法按试剂盒说明进行。检测灵敏度为16 ng/L。1.6统计学处理：数据采用，SPSS统计软件包进行统计学分析，组间比较行单因素方差分析(0ne—way ANOVA)，用最小显著差法(1east significant difference，LSD)fgINN比较，以P<0.05为差异有显著性。

　　2结 果

　　2.1 CCK 8对RSG364细胞增生的影响：单独CCK一8(10)与RSC一364细胞共孵育时，增生百分率为98.07%，-qxCN*11}It比，11~~if'-9(P>O.05);单用TNF—d(10 ng/L)处理细胞时，增生百分率为95 67%，与对照组相比差异也无显著性(P>O.05);在TNF一(10 ng/L)存在的情况下，CCK一8对RSC~364细胞的增生具有明显的抑制作用。TNF aCCK一8 10、10、10一mol/L组的增生百分率分别为87.36%、87.89%于Ⅱ86.63%，与正常对照组相比差异具有非常显著意义(P<0.01);与TNF a组相比，差异具有显著或非常显著意义(P分别<0 05、0.05、0.01);与CCK一8(10。组相比，差异具有非常显著意义(P<0.001)(见图1)。2.2 CCK 8X'~TNF a作用下RSC一364N胞生成0 05与TNF a(10 ng几)组相比P<0IL一6的影响：RSC一364细胞经24 h培养后，其分泌IL-6的基础水平为(342±36)ng/L，在TNF(10ngA。)的作用下，其培养上清中IL-6的含量与对照组相比有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。单独应用CCK一8，在浓度为10mol/L时，IL一6的含量与对照组相比，差异亦无显著性(P>0.05)。而联合应’FNF-a和CCK一8(10-l()～10—6m01/L).可使细胞1L一6生成增加，并呈现一定的剂量依赖性。其中TNF—a+CCK一8tool/L和10mol/L组的培养上清中，IL-6的含量与对照组相比有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05);而TNF—CCK一8 10moL组，培养液上清的IL-6产量显著增加，与正常对照及TNF-a对照组相比，差异均具有显著性(P<0.05)。加入CCK抗剂丙谷胺，则IL一6水平降至(351±5)rag/L，与TNF—d+CCK一8 10too[/L组相比，差异具有显著性(P<0.005)(见图2)。

　　2.3 CCK一8对CIA大鼠滑膜细胞增生的影响：CCK一8(10一、10一、10“tool/L)组细胞经120养后，细胞增生率分别为109.01%、95.64%、100.t5%，与对照组相比P>O.05。单用"rNF—d处理细胞，在浓度为10 ng/ml时，增生百分率为149.74%，与对照组相比差异具有非常显著意义(P<0.001)，表现了明显的增生刺激作用。CCK.8对此作用表现l『明显的抑制作用。TNF-a(10 ng/m1)+CCK一8 10～、10。mol/L组增生百分率分别为25.%、127.28%，与TNF—a(10 ng/m1)组相比，细胞增生百分率分别下降了23.9%和22.46%，差异具有非常显著性(P<0.01)。TNF(10 ng/mi)CCK 8 10mol/L组虽然I乜表现了一定的抑制作用，但与TNF-a(10 ng/m1)组相比，差异无显著性(P>0.05)。加入CCK受体拮抗剂丙谷胺，可消除此抑制作用，与TNF-~(10 ng/mI)组相比，P<0.05，与TNFmol/L组相比P>0.05。ai对照组与对照组比较P<0 05与丙谷胺组相比P<0 005将TNF—a浓度降为1 ng/ml，则其对CIA大鼠滑膜细胞的增生表现为抑制作用，与对照组相比，差异具有非常显著性(P<0.001)。加入10 6 moI/L的CCK一8，虽能减轻此作用，但差异无显著性(见图3)。儿组相比P<0 05.

　　3讨 论

　　类风湿关节炎是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，虽然至今病因未明，但多数研究认为，关节局部滑膜细胞的活化和增生在其发病过程中具有重妥作用。CCK一8属于脑肠肽，具有明显的抗炎作用。在整体实验中，它表现有明显的抗内毒素休克作用，可显著抑制内毒素休克大鼠血浆、肺脏和脾脏TNFL18和IL一6的产生;在离体实验中，c(、K一8司明显抑制脂多糖(LPs)诱导的大鼠肺间质巨噬细胞TNF的产生和核转录因子NF一出的活化。近年来对于与cCKl8同属于脑肠肽的血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)的研究发现，VIP具有与ccK 8类似的免疫调节和抗炎作。Delgad0等的动物实验发现，VIP显著降低了小鼠胶原性关节炎的发病率和疾病严重程度。Takeba等、的离体实验则发现，VIP对于RA患者FIs的增生具有明显抑制作用。认为VIP可能具有用于RA治疗的潜在价值。cCK一8对于FLs的增生和活化是否也有类似的作用尚未见报道。据此我们观察了ccK一8对大鼠滑膜传代细胞系RSt64细胞增生的影响，结果发现，在TNF存在的情况下，c(K一8对RS364细胞的增生具有显著的抑制作用。

　　为探讨CcKl8抑制滑膜细胞增生的可能分子机制，我们观察了8对RSC364细胞IL一6生成的影响。结果发现，在TNF。存在的情况下，促进了大鼠滑膜细胞IL一6的产生，这种促进作用表现了一定的剂量依赖性，且可为CCK受体的阻断剂丙谷胺所阻断。IL一6是一种多功能的细胞因子，对免疫系统具有双向调节作用。以往的研究多认为，IL一6在RA的发病过程中是一重要的致病因。但Nishlnlto等的新研究发现，在可溶性IL一6受体存在的情况下，IL一6对RA患者的滑膜细胞的增生具有显著的抑制作用，提示IL一6是TNF—a诱导的滑膜细胞增生的负性调节因子。本研究发现ccK在提高大鼠滑膜细胞IL6产生的同时，抑制了滑膜细胞的增生。提示提高IL一6的产量可能是ccK一8发挥其对细胞增生抑制作用的机制之一。TNF在RA的发病过程中具有关键性的作用，它是滑膜细胞增生和活化的有效刺激剂，可显著刺激RA患者滑膜细胞的增生，但对来源于正常人的滑膜细胞则无此作用。在我们的实验中，单独TNF。

　　对RSCj364细胞的增生没有表现出明显的刺激作用，而呈轻微的抑制作用，这可能是我们所用的TNF。的浓度较低、或所用细胞株为正常大鼠来源的细胞，不能完全模拟RA的滑膜细胞功能状之故。cIA大鼠模型在临床表现、病理学和免疫学改变及发病机制方面与人类RA有许多相似的特征，是研究RA的良好动物模型之。据此我们观察了rrN。对CIA大鼠滑膜细胞的作用，发现TNF。在浓度为10 ng/ml时，对cIA大鼠滑膜细胞的增生具有明显的刺激作用;(℃K 8可明显抑制此刺激作用，这种抑制作用表现了一定的剂量依赖性，且可为ccK受体的阻断剂丙谷胺所阻断;而在低浓度时(1 ng/m1)，TNF对cIA大鼠滑膜细胞的增生则表现为明显的抑制作用，ccK一8对此作用无明显影响。TNF_。发挥其生物学作用需要与其受体结合，它的受体有两种类型：TNwu和TNFR2，其中TNFRl为高亲和力受体，胞内部分含有死亡基序，主要引起细胞凋亡;TNFR2为低亲力受体，胞内部分无死亡基序，具有促进和抗凋亡的双重作用。Y。ng等的研究证明，TNF d介导的RA患者滑膜细胞增生是通过上调TNFR2和下调TNFRl的基因表达实现的。我们最近的研究也发现，这两种受体在大鼠滑膜细胞都有表达(资料未列出)，因此低浓度TNF—a抑制滑膜细胞增生的作用，可能是其优先与TNFRl结合诱导细胞凋亡所致;而其在高浓度下对cIA大鼠滑膜细胞增生的刺激作用及CcK一8对此的抑制作用，除增高lL 6的产量外，是否与这两种受体的表达调控有关，有待于进一步探讨。

　　RA的治疗是一个困扰临床多年的问题，尽管有多种药物可用，但没有哪种药物具有彻底治愈的效果。随着对本病发病机制了解的逐渐深入，生物制剂已经成了RA治疗的一个研究热点，其中用TNF一。抗体和可溶性TNF—a受体阻断TNF—a作用的研究，在动物实验和临床应用中都显示了良好效果。但由于这些制剂是大分子的蛋白质，存在着可诱导机体产生针对这些物质的抗体，从而降低治疗作用的问题。ccK一8是一个具有广泛生物学作用的神经肽，正在日益受到人们的重视。它的抗炎作用已多有报道，且作为生理活性物质和小分子多肽，不存在上述诱导机体产生抗体的问题，更适于临床应用。本研究证明了CcK_8对TNF导的大鼠FLs的增生具有明显的抑制作用，这种抑制作用可能是通过提高IL 6的水平而实现的，提示CcI8作为生物制剂，对RA的临床治疗也可能有潜在的价值;同时也发现cIA大鼠滑膜细胞和大鼠传代细胞系在生物学特性上存在有明显的差别， 其中前者可能更能反映RA的实际情况，作为RA研究的细胞模型，以应用前者更为适宜。

——转自中华风湿病学杂志

者：金玉怀